Описание проекта
Ватолин Сергей Юрьевич, PhD
Staff Scientist, Case Western Reserve University
2109 Adelbert Rd, Wolstein research Bldg., Room 2-304, Cleveland, Оhio, 44106 USA
sergei.vatolin@case.edu, vatolab@gmail.com, https://t.me/vatolabs
Аннотация. В последние годы, в связи с увеличением доли пожилых людей в популяции и улучшением диагностики, резко возросла выявляемость заболеваний, связанных с накоплением амилоидных белков. β-амилоид (Aβ) при болезни Альцгеймера, α-синуклеин при болезни Паркинсона, а также инсулин и его аналоги входят в число белков, вызывающих различные дегенеративные заболевания. которые будут активно/прогрессивно контролировать амилоидопатии различного происхождения и локализации. Следовательно, существует острая необходимость в разработке новых стратегий идентификации ингибиторов амилоида. В этом проекте описывается идентификация и частичная характеристика эффективных, нетоксичных ингибиторов образования амилоида. Нами разработан подход, направленный на идентификацию, апробацию и оптимизацию новых фармакологических вмешательств с целью установления контроля над амилоидогенезом как биологическим процессом. Учитывая чрезмерный эволюционный консерватизм молекулярных причин формирования амиоидных структур, разработка таких ингибиторов позволит существенно разнообразить терапевтические возможности за счет расширения спектра применимости в лечении заболеваний, связанных с накоплением амилоида. В качестве нового подхода к открытию веществ, способных влиять на образование патогенных амилоидов, мы использовали фармакологическую модуляцию двухфазных систем, биомолекулярных конденсатов. Мы использовали новые комбинации уже активных ингредиентов для достижения дополнительных терапевтических эффектов. Эти вещества и их комбинации давно и успешно используются в биотехнологических процессах, но не в фармакологии, в качестве активных антиамилоидных средств.
Предварительные данные. Амилоидные структуры могут быть надежно, воспроизводимо и дешево смоделированы с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА). Все данные, полученные с использованием альбумина в качестве модели, после некоторой оптимизации протокола эксперимента всегда воспроизводились на белках, ассоциированных с заболеваниями. БСА имеет тенденцию к увеличению образования β листов и амилоида при, например, нагревании, что приводит к его частому использованию в качестве модельного белка. который является границей начала амилоидообразования, появляется возможность оценить способность исследуемого фактора ускорять или замедлять ход амилоидного превращения.
Результаты. Имеющиеся ресурсы лаборатории позволили нам тестировать как отдельные молекулы, так и все их комбинации с высокой производительностью (затраченное время, деньги). Как на альбумин, так и в культуре тканей, на нормальных, «первичных» клетках (только что полученных из тканей животных или человека). В результате наших исследований были выявлены молекулы и их комбинации, которые значительно замедляют амилоидогенез в биохимических тестах in vitro. Параллельно с биохимическими исследованиями мы проверили действие выявленных смесей антиамилоидных препаратов в культуре нормальных клеток. В качестве модели мы использовали репликативно состаренные нормальные клетки человека и крысы, которые генерируют различные внутриклеточные и внеклеточные амилоидные структуры, визуализированные стандартным окрашиванием тиофлавином Т или менее традиционным, но более биологически значимым окрашиванием бис-бензамидом. Чтобы обеспечить воспроизводимость прикладных исследований на модельных животных, мы предприняли несколько методологических шагов для трансформации академических исследований в практические приложения: 1) Во всех экспериментах использовалась плазмоподобная среда человека (HPLM). ВЭЖМ была разработана на основе средних значений нормальной плазмы взрослого человека. 2) Клетки содержались на искусственном внеклеточном матриксе. 3) Были использованы нормальные человеческие клетки от четырех разных доноров, чтобы исключить влияние генетического фона. 4) Первичные клетки крысы были использованы для проверки наблюдаемого эффекта на альтернативной модели и приближения дизайна к тесту на животных.
Найдена комбинация, состоящая из нескольких молекул (поликатионов/полианионов с разной молекулярной массой и степенью ветвления), которая регулирует стабильность амилоидов в биохимических тестах, а также динамику, стабильность и удаление амилоида в первичных культивируемых клетках. Комбинаторное лечение сохранило или восстановило соматическую идентичность клеток: функцию, морфологию и пролиферативную активность. Одним из побочных эффектов удаления амилоида (или контроля его внутриклеточной динамики) явилось значительное увеличение продолжительности репликативной жизни, которое наблюдалось у всех типов клеток человека и крысы (от 50 до 100% и выше) с возможностью условной имморализации. Термин «условный» означает полную зависимость от наличия экспериментальных веществ: выведение лекарств приводит к постепенному снижению скорости пролиферации клеток и приобретению старческого фенотипа. При лечении репликативно старых (~50PD) фибробластов кожи их исходная морфология фибробластов восстанавливалась в течение примерно 72 часов с последующим формированием нормальных колоний клеток, демонстрирующих классический рисунок «отпечатков пальцев». Механизм , лежащий в основе действия соединений, включает следующие возможные пути: 1) Контроль биомолекулярных конденсатов, растворение, стабилизация. Смесь двух и более полимеров с противоположными зарядами приводит как к образованию фаз, так и к их разрушению. Результат зависит от: молекулярного состава полимеров, концентрации полимеров и солей. 2) восстановление внутрилизомального рН и лизосомальной динамики; 3) Оптимизация внутриклеточного белкового трафика.
С целью удешевления и повышения вероятности успеха эксперимента на животных были подвергнуты изучению фармакологические свойства всех соединений. Все соединения растворимы в воде. Через 48 часов большая часть соединения Е (11-21%) оставалась в различных органах. Существенных различий между путями введения (ИП, ВВ или перорально) не выявлено. Он обладает умеренной токсичностью (начиная с ~100 мг/кг, биологически эффективная доза < 1 мг/кг) и полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта. Это вещество не является генотоксичным, не мутагенным и не тератогенным. P соединение (полимер) имеет несколько аналогов с разной молекулярной массой и степенью ветвления. Соединение характеризуется: 1) низкой токсичностью; 2) высокая биодоступность; 3) распределение по всему телу; 4) после однократного приема его можно обнаружить через 48 часов. В клинике используются соединения Е, Р, D.
Текущий этап проекта направлен на тестирование и подтверждение эффектов фармакологических комбинаций на животных.
1) В связи с уязвимостью старых особей и значительными затратами на одно животное, мы проведем стандартные исследования ФК/ФД для оптимизации и надежного определения терапевтической дозы у молодых или зрелых животных.
2) Итоговый протокол будет использован на статистически значимой выборке старых животных с явными признаками амилоидопатии.
Гистологический анализ амилоидопатии, анализ транскриптома/протеома будет проведен на небольшой, но статистически значимой группе животных. Также будет оценена стандартная выживаемость при нормальном старении.
3) Несмотря на то, что все молекулы в предложенных комбинациях были протестированы в клинике (фаза I) и признаны безопасными, их комбинация нуждается в повторном тестировании и оценке на безопасность. Клинические испытания могут быть начаты в кратчайшие сроки, в зависимости от договоренности с аккредитованной организацией здравоохранения.